由于用医学蛭类提取和纯化出天然水蛭素非常困难，产量太少大大限制了对它的研究和应用。近二十年来，分子生物学和基因工程技术迅速发展，使得大量合成重组水蛭素成为可能，从而推动了重组水蛭素在药理学和医疗临床方面的研究工作。自从1986年以来，国外及我国国内已有许多实验室利用DNA重组技术将化学合成的水蛭素基因克隆进大肠杆菌和酵母细胞中，并得到了具有生物活性的重组水蛭素。从医学蛭类头部提取RNA,再应用CDNA法合成水蛭素基因也获得了成功。目前国外已有多家生物技术公司正在尽力将重组水蛭素开发成为治疗脑心血管疾病的新药，如法国的Transgene公司和Sanofi公司，德国的Genbiotec公司和Hoechst 公司，瑞士的Ci-ba-Geigy公司，美国的Sri公司和Biagen公司等。据我国的国外医药杂志报道欧共体已批准Novartis公司的重组水蛭素上市，美国批准了Medicines公司的重组水蛭素衍生物（片段）比伐卢定（Bivalirudin, Angiomax TM）上市，德国Hoechst Marion Roussel公司的抗凝药Lepirudin (商品名Refludan ；化学名 1 - L - 苏氨酸-63-脱硫水蛭素)已在欧美上市。在美国 Sigma生化试剂公司现今的产品价目表中也列出了用酵母菌细胞生产的重组水蛭素以及各种重组水蛭素片段的规格和价格（见附录I）。我国也有多个科研院所和高等院校正在用不同的方法进行重组水蛭素的合成研究和药物开发，国家也已将其列为“八五”科技攻关项目,其中复旦大学分子医学教育部重点实验室宋后燕教授领衔研究的“注射用基因工程双功能水蛭素”获得国家有关部门批准正式进入临床研究。北京大学生物化学与分子生物学系朱圣庚教授领衔研究的转基因水蛭素技术已转让给汕头双骏生物医药有限公司。现将有关方面的国内、外情况分别介绍如下。
(一) 重组水蛭素的合成
目前各国合成重组水蛭素主要采用了以下几种方法：
Bergmann, C. 等人（1986）在 Hoppe-Saler生物化学杂志第367期上报道了应用化学合成的寡聚脱氧核苷酸，通过酶连接到水蛭素基因226-bpDNA上。在大肠杆菌中，在乳糖启动子的控制下，水蛭素的合成基因与β-半乳糖苷酶一起作为一个融合蛋白获得表达，或者在αPL启动子控制下，作为一个非杂交蛋白获得表达。这种非杂交蛋白产物具有水蛭素的生物活性。具体做法是根据已知水蛭素的氨基酸序列，设计18个寡聚脱氧核苷酸片段。为了促进整个基因的合成，将其分成A, B, C三段，并装配有适当的限制酶的切位点。作者在基因装配方面用了两种方法，一种是首先合成短的交叠互补寡聚核苷酸（10-30核苷酸单位），再用酶促连接方法产生双链DNA片段；另一种是合成较大的单链DNA片段（30核苷酸单位以上），经退火得到完整的双链DNA片段。后者称为补平法，只需合成和纯化少量的寡核苷酸，就能获得5 – 10倍的双链基因片段，又能去掉磷酸化步骤。补平法制备全长的双链DNA片段产率较高，片段的克隆也更容易完成。用非融合蛋白表达水蛭素更加合适，
Dodt, J. 等人（1986）在FEBS Lett. 第202卷第2期上报道了应用硷性磷酸酶信号序列在大肠杆菌中表达、分泌和加工水蛭素。首先合成一个为大肠杆菌硷性磷酸酶（PHOA）信号肽编码的DNA片段，并将此片段插入PKK2233表达载体中。在此信号肽的末端紧随Hind酶切位点。将化学合成的水蛭素基因插入此酶切位点中，在半乳糖苷酶启动子的控制下，该杂交蛋白得到表达，并分泌到大肠杆菌的外周胞质中。具体做法是寡聚脱氧核苷酸SP1和SP2以固体硅胶作支持剂手工合成，SP3和SP4用磷酸酰胺法在DNA合成仪上进行装配，然后用HPLC纯化这些寡核苷酸。用这四个合成的寡聚脱氧核苷酸SP1至SP4合成一个为硷性磷酸酶信号肽编码的DNA片段。此DNA片段插入PKK2233表达载体的EcoR1和Hind酶切位点处。形成的载体PHIR21含有水蛭素基因，该载体在一半乳糖苷酶启动子的控制下，进行融合蛋白的合成，这个合成过程从N端开始，首先合成信号肽PhoA，紧接着是水蛭素的合成。大肠杆菌BMH71-18在含有氨苄青霉素（100µg/ml）LB培养基中在37℃下培养，应用IPTG诱导基因表达其浓度为0.5mM。水蛭素活性，是在25℃下通过生色底物ChromzymTH来测定。基因表达诱导24小时后，从大肠杆菌（BMH71-18）载体 PHIR21的胞质抽提液测得350AT-U的水蛭素抗凝活性单位。将大肠杆菌的胞质抽提液通过DEAE-Sephadex-25柱进行分离纯化并用HPLC进一步纯化，最后得到的两个色谱峰的抗凝活性为550 – 570 AT-U/mg。
Loison, G.等人（1988）在生物技术学杂志(Bio/technology)第6期上报道了用酵母细胞有效地生产重组水蛭素变异体Ⅱ(r–HV–2 )。他们将成熟的水蛭素编码序列放入酵母Mfal基因前序列框架中，可转录不同融合基因的多拷贝质粒含有Mfa1的启动子，在尿嘧啶原营养型中用此质粒转化一个酵母菌株。从其酵母培养基上清液中蛋白质的分析表明，在所有的情况下水蛭素都能有效地分泌。但是只有紧随着YSEF裂解位点含有成熟的水蛭素变异体Ⅱ（HV–2）序列的前体，才能够正确加工产生具有生物活性的水蛭素。具体做法是从医学蛭类头部分离出一种多A•RNA,制备一个c – DNA库。从此c – DNA库（天然水蛭素编码HV–2）分离出一个Pst1片段，克隆进PBR322 的Pst1位点(pTG717)。从pTG717所得的Pst1片段（含有水蛭素基因）经纯化后，用Hinf1 和Aha111酶解，此Hinf1―Aha111片段(225bp)与合成的寡核苷酸混合。这些设计的寡核苷酸用以重新构建成熟的水蛭素变异体Ⅱ（HV–2） 编码序列，并在5´―末端加上一个ATG起始密码。重新构建的基因插入 pTG880的Bg111和Sma1位点，新生成的质粒pTG 882 中，水蛭素序列在PGK转录信号控制下进行表达。质粒pTG1819装配pTG 881，这里的Mfa1编码序列是在PGK启动子控制下，取代它原来的启动子。在pTG1818发酵液中，用反相层析HPLC进行纯化，得到一个重组水蛭素活性峰的比活性为13000 AT-U/mg，得到另一较低的重组水蛭素活性峰的比活性为4000 AT-U/mg。 在pTG1833发酵液中，用反相层析HPLC进行纯化，得到一个重组水蛭素活性峰的比活力为13000 AT-U/mg，N端序列与水蛭素变异体Ⅱ（HV–2）序列相符合。水蛭素分子N端的1 – 5个氨基酸与C端区形成紧密的结合，而此结合状态直接影响水蛭素的活性。当天然水蛭素（HV–2）的N端略微延伸几个氨基酸，将大大降低水蛭素的活性。当N端多加一个蛋氨酸时，重组水蛭素变异体Ⅱ（r–HV–2）抗凝血酶降低活性5倍。实验结果表明应用大肠杆菌生产水蛭素的产率很低，原因之一是在其N端需要多加一个蛋氨酸作为起始密码，另一原因是水蛭素在大肠杆菌细胞中发生蛋白质的降解作用。用酵母菌可将异质蛋白质分泌到培养基中，而且形成的多肽不含有多余的起始密码一蛋氨酸。
中国科学院生物物理研究所申同建等人（1991）在中国科学B集第8期上报道了人工合成的水蛭素基因在酵母中的表达。他们根据水蛭素变异体Ⅱ（HV–2）氨基酸序列设计并合成了水蛭素基因，在酵母α– 因子表达系统中表达。经过诱变得到稳定的携带水蛭素表达质粒的酵母菌株，在培养基中培养36 – 48小时后，可以在培养液中测得10 – 20AT-U/ml分泌水蛭素表达产物。经纯化得到色谱纯(HPLC)的水蛭素，其N端氨基酸序列与天然产物完全相同，具有强烈的抗凝血和抑制凝血酶活性。从500 ml培养液中可以得到约3000 AT-U的纯水蛭素，比活力为6600 AT-U/mg。
中国医学科学院血液研究所郭娟、王荷碧等人（1995）在中华血液学杂志第9期上报道了水蛭素变异物1活性多肽基因的化学合成及克隆。她们根据水蛭素变异物（HV1）的氨基酸序列，选择在原核细胞中高表达的密码子，设计了221个硷基对长度的HVI DNA片段。分成14个寡核苷酸片段进行化学合成，各片段连接成为HVI全基因后，细EcoRT、BamHI切点克隆入PUC18/19质粒，转化大肠杆菌JM105，兰白菌落法筛选阳性克隆。限制性内切酶实验以及DNA序列分析证实了HVI全基因的正确性，克隆成功并获得了活性表达。
上海医科大学分子遗传研究室顾银良和罗春真（1996）在上海医科大学学报第3期上报道了水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳动物细胞中的表达。他们设计了特异性更高的水蛭素新变异体，化学合成了编码水蛭素基因，并融合了RGD3肽编码序列。通过连接、克隆、酶切筛选、DNA序列分析得到真核表达质粒pAPR – HD, 表达质粒转染CHL细胞，经G418 筛选，获得了表达克隆。结果：细胞培养液中，重组水蛭素衍生物的活性达到10AT-U/ml, 并有抗血小板凝集作用。结论：水蛭素新变异体具有预防血栓性疾病的应用前景，但其表达水平和稳定性有待进一步提高。
军事医学科学院毒物研究所刘刚和慕邵峰（1998）在中国药物化学杂志第1期上报道了合成水蛭素羧端肽段及其类似物的抗凝活性。水蛭素C端肽段为抗凝的活性部位。为了进行构效关系的研究，构建C端肽段类似物的化学库，他们首先利用同步多中心合成技术合成了7种水蛭素C端肽段类似物。经HPLC制备纯化，纯度为96%以上。电喷雾质谱确认了合成肽的分子量。用新鲜人血浆进行了凝血酶原激酶时间(APTT)，凝血酶时间(TT)及凝血酶原时间(PT) 测定。显示水蛭素羧端20个氨基酸残基肽片是抗凝活性必须的基本骨架。其中应当包含封闭凝血酶催化位点和阴离子结合位点的特异结合序列以及保持
中国药科大学生物制药教研室谭树华、吴梧桐等人（1998）在药物生物技术第1期上报道了水蛭素变异体Ⅲ（HV3）基因合成、克隆与鉴定。她们根据水蛭素变异体Ⅲ（HV3）的氨基酸序列设计并合成了六对共12条寡核苷酸链。经退火配对，连接成完整的HV3编码基因228bp)，并克隆到载体 PUC18中。通过α-互补及小量抽提质粒酶切鉴定，筛得阳性重组水蛭素，克隆其中PUCH33，经正、反向引物测序、鉴定，与设计的序列完全相符。谭树华、吴梧桐等人（1999）在中国药科大学学报第1期上报道了在大肠杆菌中分泌表达水蛭素变异体Ⅲ基因的初步研究。她们设计合成了两对（四条）寡核苷酸链，经退火、拼连成L―门冬酰胺酶信号肽简并基因，同时利用密码子的简并性在该基因3′端基因内引入了一个Nhe I限制酶切位点。此外，用PCR技术在HV3基因5´端引入Nhe I限制酶切位点，利用该酶切位点将信号肽基因与HV3基因进行连接并且保护原有阅读框架不变，构建了重组质粒pUCSH，测序结果表明融合基因核苷酸序列与设计要求完全一致，将该融合基因插入pKK2332中构建成HV3分泌表达质粒pKSH并在大肠杆菌中分泌表达。谭树华、吴梧桐等人（1999）在中国生化药物杂志第1期上报道了新型大肠杆菌融合表达系统表达水蛭素变异体Ⅲ基因研究。她们选用大肠杆菌L―门冬酰胺酶(ASPs II)高效表达质粒PKA作为融合表达载体，将水蛭素变异体Ⅲ（HV3）人工合成编码基因插入pKA质粒的ASPs II编码基因 ansB中，使ASPs II 1N端的89个氨基酸残基通过甲硫氨酸残基与HV3形成融合蛋白，从而构建成ASPsII – HV3 融合蛋白表达质粒pKAH，通过基因操作将该质粒的低拷贝数复制原点更换成pUC 高拷贝数复制原点，进而构建成 ASPs II – HV3融合蛋白高效表达载体pUKAH。该质粒在大肠杆菌JM105宿主细胞中表达后，融合蛋白(15.6KD)占细菌总蛋白的105%。该校李兵、谭树华等人（2002）在药物生物技术第2期上报道了水蛭素基因工程菌培养。他们采用了正交实验法优化了水蛭素基因工程菌的发酵培养基，得到较佳的培养基配方及培养条件，优化了发酵工艺。摇瓶培养22小时，发酵液抗凝血酶活性可达850 AT-U/ml。25升发酵罐培养18小时，发酵液中抗凝血酶活性亦可达800 AT-U/ml。水蛭素表达量在原有基础上有了大幅度提高，为大规模培养及工业化生产建立了可行路线。
中国中医研究院基础所王克林、徐琦等人（1999）在中国海洋药物第1期上报道了热启动聚合酶链反应快速扩增水蛭肽基因的研究。他们指出应用这种技术可使DNA为221bp, 这与理论预计相符，同时确定了退火温度为50℃时的扩增反应结果较好，这为进一步探讨水蛭肽基因克隆、表达与调控规律打下了基础。徐琦、王克林等人（2000）还在中国中医基础医学杂志第5期上报道了水蛭抗凝多肽基因在大肠杆菌中的表达。他们应用我国产的吸血水蛭通过逆转录酶和PCR技术取得了水蛭素基因并将其克隆进质粒PGEM – 32f(+)中，应用所得水蛭素基因克隆进我国特有的表达载体PBV – HV菌株。该菌株通过发酵实验获得了高效表达并得到具有生物活性的水蛭素。菌体
南京大学生物化学系范尧、王进等人（2001）在生物化学与生物物理进展第1期上报道了一种水蛭素类融合蛋白与凝血酶作用的动力学模拟。他们通过将凝血酶抑制剂水蛭素的C端20肽片段嫁接到血小板结合蛋白Annexin V上，可以期望获得即具有抗凝血活性，又具有导向性的新型工程蛋白质分子，利用计算机辅助分子设计手段模拟该融合蛋白质分子结构，并对该融合蛋白对凝血酶的抑制作用进行了分子动力学模拟，验证了上述想法。
第二军医大学附属长海医院心内科穆瑞斌、秦永文等人（2002）在中华医学杂志第9期上报道了重组多功能抗凝多肽的表达及活性测定。他们设计了一个具有多重抗凝功能的重组多肽分子结构，由谷胱甘肽S转移酶（STST）作为载体蛋白与重组抗凝多肽融合而成。编码重组抗凝多肽的DNA序列是根据氨基酸序列逆向翻译后经人工合成，并插入表达质粒pGE x 5 x 3 中，与其中的编码GST序列的3′端融合。采用大肠杆菌DH500进行原核表达。应用亲和层析的方法得到纯化的融合蛋白。重组抗凝多肽含有31个氨基酸，由3个功能部分组成。
长春中医学院附属医院和长春生物制品研究所翁梁、刘丹等人（2002）在中国生化药物杂志第2期上报道了PCR方法在水蛭素基因克隆方面的新用途。他们改进了传统的PCR方法，根据已知天然水蛭素基因序列设计了一对123 nt且3′端具有15 nt互补序列的单链DNA。通过低温复性使其互补结合后，进行延伸反应，得到微量双链水蛭素基因。再以该基因作为模板设计一对引物，进行常规PCR扩增反应。结果获得了水蛭素基因。此法对于获得象水蛭素基因这类序列，已知片段不太长，且为不易得到的基因提供了一种可行方法。
南京理工大学化工学院李大力等人（2002）在生物技术第3期上报道了水蛭肽基因的克隆及其转化甘蓝。他们将合成的水蛭肽基因转移至甘蓝，构建了水蛭素的植物表达载体PROK – L，使用甘蓝的下胚轴和根瘤农杆菌的共培养实现了转化，再生植株经卡那霉素筛选，检测结果表明所得到的抗性植株均为转化基因植株，获得了转化水蛭肽基因的甘蓝植株。又据悉上海农业科学院等单位正合作进行水蛭素转基因作物种植与相关深加工的研究。
（二）重组水蛭素的药理学研究
重组水蛭素与天然水蛭素在结构上稍有不同，即位于63位酪氨酸处是非硫酸酯化的，这使得它与凝血酶的结合能力只有天然水蛭素的1/10 – 1/15。如果将重组水蛭素硫酸酯化，则与天然水蛭素的作用相差无几。血管内血栓的形成，虽然有多种原因，但最根本的过程还是凝血酶引起的凝血作用。许多血栓形成的动物模型已用于重组水蛭素的抗栓作用研究，有的还和肝素作了比较。现将有关重组水蛭素的药理学研究现状分述如下。
Nowak, G.等人(1988) 在Folia Haematol.（溶血）(Leipzig) 第115期上报道了重组水蛭素在狗体内的药物动力学研究。雌性警犬的体重为17 –19.5公斤，在给药前和给药后的一定时间间隔内，检测血样和尿样，直至480分钟为止。给药的方法是静脉注射，静脉点滴，皮下注射。重组水蛭素与天然水蛭素在狗体内的动力学行为很接近。不论是静脉给药还是皮下给药，两种水蛭素都能得到几乎相同的血浓度。两者的差别主要表现在重组水蛭素通过肾脏的排出率比天然水蛭素的排出率要高20% – 25%。重组水蛭素只通过肾脏排出，几乎不经过其它代谢的消除过程。Henschen, A. 等人(1988)在该刊同一期上将两种水蛭素通过肾脏前后进行了比较，通过反向HPLC分离，氨基酸组成和序列分析证明了水蛭素是经过肾脏以不改变活性的形式从尿中排出的。
Doutremepnich, C.等人(1991)在止血杂志（Haemostasis）第21卷增刊1上报道了三种重组水蛭素的抗静脉血栓作用，并与肝素作了比较。重组水蛭素I是由酵母菌制得的，重组水蛭素II和Ⅲ是由大肠杆菌制得的，肝素未经分馏。实验结果表明肝素的高剂量组（400µg/kg）和重组水蛭素II的各个剂量组及重组水蛭素Ⅲ的高剂量组（50µg/kg）均有明显的抗血栓作用，重组水蛭素I的各个剂量组虽然能使血栓重量有一定程度的减少，但无统计学上的意义。这表明三种重组水蛭素的活性也是不完全一样的，这可能是由于合成方法的不同而得到不同结构的重组水蛭素造成的。Talbot, M. D. 等人(1991)在该刊同一期上报道了重组脱硫水蛭素(desulphatohirudin)对大鼠动脉血栓症的作用。他们通过机械损伤（用夹子反复夹紧大鼠的动脉血栓）形成模型。损伤部位血液成分标记的放射性强弱（111I标记血小板，53Cr标记红细胞，125I标记纤维蛋白原和纤维蛋白）作为定量测定血栓形成程度的指标。他们研究了重组水蛭素的抗动脉血栓作用，并与未分馏肝素以及低分子肝素Fragmin作了比较。结果证明皮下注射重组水蛭素能够抑制纤维蛋白和血小板在损伤血管上的积累，并且这种作用与皮下注射剂量有关。
我国核医学国家重点实验室、江苏省原子医学研究所万卫星、张荣军等人（1999）在中华核医学杂志第4期上报道了99Tcm –重组水蛭素的制备及血栓动物模型显像研究。他们采用亚氨基噻吩盐酸盐修饰法制备99Tcm –重组水蛭素（99Tcm –rH），并进行小鼠体内分布及兔股动脉、静脉血栓模型显像分析。结果表明：99Tcm –rH的标记率为90.8%，PD10过柱前后放化纯度分别为88.8%和93.9%，比活度为3292GBq/g; 在小鼠心、脑、肝、脾、肺摄取低，肾浓聚高，15分钟达到（64.72±5.04）% ID，血清除迅速；兔股动脉、静脉血栓1小时可清晰显影，T/B分别为224和195。万卫星、张荣军等人（1999）在该刊同一期上报道了血栓动脉模型的99Tcm –重组水蛭素显像研究。为了探讨以凝血酶为靶，重组水蛭素（rH）为配基进行血栓显像的潜在价值。采用氯胺T法制备125 I–rH，以及体外放射配体结合法分析rH对凝血酶，纤维蛋白复合物的亲和、定量关系和时间反应动力学。采用亚氨基噻吩盐酸盐修饰法制备99Tcm –重组水蛭素（99Tcm –rH），进行小鼠体内分布测定及犬动脉、静脉血栓模型显像。结果表明rH不能直接与纤维蛋白原结合，当凝血酶与纤维蛋白形成复合物后才能与其形成三元复合物，且这种结合呈高亲和，特异和可逆性。99Tcm –rH在小鼠心、脑、肝、脾、肺摄取低，肾浓聚高，15分钟达到（64.72±5.04）% ID，血清除迅速；兔股动脉、静脉血栓1小时可清晰显影，T/B分别为224和195。该室谭成、万卫星等人（2000）在核技术第5期上报道了重组水蛭素与血栓前体关系的研究。氯胺 – T法碘标水蛭素，采用固相饱和法，固相竞争法分析水蛭素与凝血酶 – 纤维蛋白原复合物的亲和力及定量结合关系，并分析水蛭素 – 凝血酶 – 纤维蛋白原复合物形成三元复合物，它们的分子配比为14:14:1(水蛭素 : 凝血酶 : 纤翴蛋白原)。生理Ca∽(2+)浓度是它们的最佳结合环境，水蛭素与凝血酶 – 纤翴蛋白原复合物结合的亲合常数K-a为9.72 x 10∽6L/mol;其结合反应可在30 – 45分钟达到平衡；提示重组水蛭素有作为新型血栓显像剂的可能。张荣军、万卫星等人（2000）在核技术第11期上报道了新型血栓显像剂99Tcm –重组水蛭素的实验研究。结果表明用间接法制备的99Tcm –重组水蛭素具有更高的放化纯和稳定性，更适合于血栓模型的显像研究。兔血栓模型显像结果表明99Tcm –重组水蛭素可在血栓部位浓聚；注入后1小时即可使血栓清晰显像，因此，可望成为一种新型血栓显像剂。
第四军医大学唐都医院心内科田建伟、赵连友等人（2001）在第四军医大学学报第21期上报道了重组水蛭素局部治疗兔髂总动脉球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄。他们为了探讨重组水蛭素经多孔球囊导管局部治疗对兔髂总动脉球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄的影响，用24只纯种日本大耳白兔随机分成对照组（n = 12）和重组水蛭素局部治疗组（n = 12），采用兔髂总动脉球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄模型，治疗组经多孔球囊导管于球囊扩张局部在2个大气压下给于重组水蛭素（13.8ⅹ106抗凝血酶单位•g1 ）1 mg•Kg1，对照组给于生理盐水，术后2WK和4 WK复查血管造影，术后4WK取髂总动脉标本行HE染色、Masson三色染色、平滑肌肌动蛋白(α actin)免疫组织化学染色和增殖细胞核抗原免疫组织化学染色, 并进行了计算机画像分析。结果：治疗组术后2 WK和4WK平均髂总动脉直径均较对照组显著扩大[2WK（86±5）% us(56±10)%, P<0.01; 4WK(77±13)% us(56±10)%, P<0.01], 术后2 WK和4WK平均髂总动脉面积亦显著增加，术后4WK治疗组球囊扩张血管管腔面积较对照组显著增加[（37±5）% us（84±5）%，P<0.01]，其管壁面积显著减少[（63±5）% us（38±10）%，P<0.01]，其中主要是内脏面积减少[（7±1）% us（38±10）%，P<0.01]，术后4WK治疗组球囊扩张血管管壁α–actin和 PCNA免疫组织化学染色阳性细胞均较对照组明显减少。结论：重组水蛭素经多孔球囊导管局部治疗可显著减轻兔髂总动脉球囊扩张术后新生内膜增殖和管腔狭窄。
中国药科大学生物制药教研室刘煜、谭树华等人（2002）在中国药科大学学报第3期上报道了重组水蛭素Ⅲ的抗凝与抗血栓作用研究，为了研究自行研制的重组水蛭素Ⅲ在大肠杆菌中的分泌表达产物的抗凝与抗血栓作用。他们采用大鼠下腔静脉血栓模型和大鼠体外AV循环模型进行水蛭素Ⅲ（HV3）的抗凝与抗血栓作用研究。结果给予重组水蛭素25，50µg/kg 两个剂量的大鼠下腔静脉血栓重量分别为21.30±7.35 mg和10.40±16.20 mg，生理盐水对照组为59.50±4.95 mg；重组水蛭素50，25µg/kg的血栓湿重为15.3±3.6 mg和21.5±5.3 mg，生理盐水对照组为48.6±4.9 mg。结论：重组水蛭素Ⅲ可显著地减少静脉血栓重量，也能显著地降低体外AV循环的血栓湿重。
第四军医大学吕莉和大连医科大学李欣燕等（2002）在中草药第6期上报道了重组水蛭素抗凝活性的实验研究。研究重组水蛭素的抗凝活性，以便为水蛭素新药开发提供实验依据。采用家兔静脉注射重组水蛭素前及后心脏采血，应用血凝仪测定凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）和活化的部分凝血活酶时间（APTT），并考察其抗凝活性的量效和时效关系。结果重组水蛭素能明显延长TT和APTT，且呈剂量依赖性，但在所试剂量范围内对PT无明显影响；其延长TT和APTT的作用随时间而下降，作用持续时间60分钟。结论：重组水蛭素具有明显的抗凝作用，明显强于现有抗凝药肝素，且其作用强度与同剂量的德国产重组转基因水蛭素相同。第四军医大学吉林军医学院吕莉、王艳春、韩国柱等（2002）在中国药学杂志第9期上报道了重组水蛭素抗栓及抗弥散性血管内凝血作用的实验研究。重组水蛭素产品中仅变异体I、Ⅱ、Ⅲ具有抗凝活性，简称rHV1、 rHV2、 rHV3，，国内有关单位采用甲基营养型汉逊酵母真核表达系统研究出的重组水蛭素（rH）与天然水蛭素HV1不同之处，除rH-63位酪氨酸脱硫基外，还有N末端为N-Ile-Thr2型，这为国内外首创，此文研究了此种rH的抗动、静脉血栓及家兔急性弥散性血管内凝血作用，旨在为重组水蛭素新药开发提供科学实验研究资料。结果表明rH具有强大的动脉、静脉和抗DIC作用，并呈明显的剂量依赖性关系，其抗静脉血栓有效剂量为12.5 – 100 µgkgˉ1,远低于抗动脉血栓的有效剂量（0.25–2.0 µgkgˉ1）,于与国外文献报道相似，rH抗DIC的有效剂量很低（15.625 - 125µgkgˉ1）, 当剂量仅为125µgkgˉ1时，试验过程中各项观察指标均与NS组相同，即完全对抗DIC，rH 抗静脉血栓作用强度约为肝素的4倍，其抗动脉血栓作用强度约为赖氨匹林的50倍，其抗DIC作用强度约为肝素的2倍以上，国产rH的抗动、静脉血栓及抗DIC作用强度与德国同类权威产品Refludan一致。发现静脉注射rH后效应，出现双峰现象，峰值时分别为15分钟和2小时。未出现血药浓度的双峰现象，提示效应的双峰现象与药动学过程无关，很可能是特殊的药效动力学因素所致。本品抗动脉血栓效应时程为单峰，似可用血管外给药需要经受吸收过程予以解释。此文描述的方法能够成功地诱发家兔急性DIC，此法简便，造模成功率高。
（三） 重组水蛭素的临床试验
Bichler, J. 等人 (1988) 在Arzneim – Forsch 第38卷第5期上报道了在16名健康志愿者身上做的重组水蛭素临床研究。他们用0.1 – 0.4mg/Kg皮下注射一次或用0.3 –0.5 mg/Kg皮下注射多次后，采用生色底物或ELISA方法测定血浆或尿中重组水蛭素的浓度，其血浆浓度可用开放的一房室模型来表示。药物动力学参数的平均值为：消除半衰期为127分钟，总消除为206 ml/分钟，吸收速度常数为0.86/小时，肾脏消除为66 ml/分钟，这些参数随着剂量的变化而稍有改变。在24小时内，进入人体的重组水蛭素有32%自尿中回收，血液凝固时间与重组水蛭素的血浆浓度有关。凝血激酶时间(APTT)是最适宜的检验指标。每8小时注射一次，共注射八次，结果在3秒钟时间内有效地延长了APTT。重复注射，在前一次注射的重组水蛭素未完全排泄前又注射一次，但在血浆内未见重组水蛭素积累。人体对注射的剂量是可以耐受的，血相、出血时间和血液化学成分均不受影响。一般无特异抗体发现，只有一名受试者在6周后皮试有阳性反应。
Klocking，H. B. 等人 (1988) 在Folia Haematol.（溶血）(Leipzig) 第115期上报道了对重组水蛭素做的全面毒性研究。无论是急性、亚急性毒性实验，都没有异常反应，对体重、血相、呼吸系统和心血管系统都没有影响，尿样分析、免疫学检查也都正常，半致死剂量为LD50 > 250mg/Kg。
Markwardt, F. 等人（1991）在止血杂志（Haemostasis）第21卷第21期上报道了用重组水蛭素做的临床药理研究，他们给健康的志愿者进行单次静脉注射，单次皮下注射或重复皮下注射。结果表明凝血酶时间和部分凝血酶原时间取决于血浆中重组水蛭素的浓度，血小板计数、纤维蛋白原水平和纤维蛋白分解系统保持不变，出血时间未延长。静脉注射时，重组水蛭素迅速分布到细胞外部空间并排出，半衰期为1 – 2小时，与静脉注射剂量有关。皮下给药时，重组水蛭素在血中的浓度在60 – 120分钟内达到最高值。大部分活性重组水蛭素以未改变的形式自尿中排出，实验结果与天然水蛭素的结果相近。
在我国国外医药杂志1994年第3期上报道了新型凝血酶抑制剂水蛭肽（Hirulog）对冠脉疾病的抗凝效果。这是一种选择性凝血酶抑制剂，取名水蛭肽（Hirulog）它是不同于肝素的新型抗凝药物，是仿照水蛭素（Hirudin）结构合成的含氨基酸的多肽，能有效地选择性地抑制那些结合于血块的凝血酶，而不因为血小板被激活而失效。45例作心导管检查的冠脉疾病患者，在心导管术中随机给予小剂量的水蛭肽（静脉注射0.05 mg/Kg，继续以滴注每小时0.2 mg/Kg）、大剂量（静脉注射0.15 mg/Kg，继续以滴注每小时0.6mg/Kg）或肝素（静脉注射500U）。给药期间定时连续测定活化部分凝血激酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、激活凝血时间（ACT）和纤维蛋白肽A(FPA)。该刊1995年第1期上报道了水蛭肽（Hirulog）对不稳定性型心绞痛的治疗价值。文中指出人工合成的水蛭肽是一种直接的凝血酶抑制剂。20例男性不稳定性型心绞痛患者经静脉滴注水蛭肽（每小时0.2mg/Kg），连续5日；在治疗中保持活化的部分凝血激酶时间（APTT）大约延长200%。在连续静脉滴注水蛭肽5日期间，APTT由治疗前的26、84、0秒延长至61、610、2秒；凝血酶原时间（PT）由治疗前的12.1±1.3秒延长至16.1±2.0秒；纤维蛋白肽A(FPA)水平由治疗前的48±15.1 µg/ml降至27.4±9.5µg/ml。该刊1996年第3期上报道了水蛭肽（Hirulog）治疗不稳定型心绞痛。文中指出粥样硬化斑块破裂，血小板激活和冠脉血栓形成在不稳定型心绞痛发病原理中有重要作用。抗血小板药阿司匹林、抗凝药肝素已被列入不稳定型心绞痛的常规治疗药。但是肝素不能抑制结合于血块的凝血酶，使用时必须反复调整剂量，监测抗凝效果，可能引起大出血。水蛭肽则是一种高度特异性的游离和结合于血块的凝血酶抑制剂的直接抑制剂。410例不稳定型心绞痛患者，每日口服阿司匹林325 mg，随机恒速静脉滴注水蛭肽，剂量分别为每小时0.02 mg（160例）、0.95 mg（81例）、0.50 mg（88例）和1.0 mg（181例），共计72小时，结果发现72小时和出院时水蛭肽剂量组明显好于阿司匹林剂量组。该刊1996年同一期上还报道了水蛭肽和肝素对冠脉成形术患者安全性的比较。文中指出冠脉成形术中应用的新抗凝药和抗血小板药几乎都使出血并发症增加。水蛭肽是凝血酶的直接抑制剂，在理论上同肝素相比有许多优点。4312例不稳定型心绞痛或梗塞后心绞痛作经皮穿刺冠脉内成形术（PTCA）, 随机给予水蛭肽或肝素，以比较两者安全性。水蛭肽剂量是静脉注射1.0 mg/Kg，继续以滴注每小时2.5 mg/Kg，共4小时，再以每小时0.2 mg/Kg滴注14 –20小时。肝素剂量是静脉注射175 U /Kg，继续以每小时15 U /Kg滴注，共计18 – 24小时。结果发现水蛭肽组出血和其它副作用发生率低于肝素组；呕血人数分别为0.8%和1.9%（危险比0.41，90%）。该刊1996年第6期上报道了凝血酶抑制剂重组水蛭素CGP39393用于髋部置换术后深部静脉血栓的预防。文中指出深部静脉血栓（DVT）是较大矫形手术后严重而常见的并发症。近期的资料显示尽管用肝素预防，全俄的膝关节置换术后的DVT发生率为20 – 45%。水蛭素是一种天然的，特异性的几乎不可逆的人凝血酶抑制剂。本试验采用的CGP39393是一种通过DNA重组技术在酵母菌上表达的重组水蛭素。837例随机分成为4组：即CGP39393 10、15、20 mg以及混合肝素500 U共4组。CGP39393各组均为每日2次皮下注射，肝素组为每日3次皮下注射；前者首次给药是在麻醉手术前进行的，后者则在手术开始前2小时给药，治疗期间均为8 – 11天。结果显示手术后预防期内CGP39393 10、15、20 mg剂量各组静脉血栓的发生明显低于混合肝素组。该刊1998年第5期上钟倩报道了地西卢定预防髋部置换术后深部静脉血栓形成。文中指出据欧洲研究者报道Novartis公司的凝血酶抑制剂地西卢定（Dsirudin, 商品名Revasc）对进行髋部置换手术病人的深部静脉血栓(DVT)预防作用优于依诺肝素钠。在这一研究中，2051例来自10个欧洲国家进行全髋部置换手术的可评估病人随机接受本品皮下注射15 mg，一日两次（1028例）或依诺肝素钠皮下注射40mg，一日一次（1023例），共治疗8 – 12天。病人在手术前30分钟接受首剂本品，而首剂依诺肝素钠在手术前夜给药。治疗过程中785例依诺肝素钠接受者和802例本品接受者可进行首次治疗分析评估。分析结果：依诺肝素钠组较本品发生大的血栓栓塞。该刊1998年同一期上钟倩还报道了重组人抗凝血酶Ⅲ影响肝素的抗凝血作用。文中指出Genzmpe Transgenics公司和Genzpoe General 公司的重组人抗凝血酶Ⅲ可影响用于进行冠脉旁路移植术(CABG)病人的肝素抗凝血作用。在美国圣地亚哥召开的美国血液学协会年度会议上，这两家公司的研究者陈述了一项D期临床研究结果。他们认为这是已成功完成的转基因产生的重组人治疗蛋白的第一个研究。此研究中的30例病人在首次进行冠脉旁路移植手术前接受了肝素和单次剂量的本品10 – 200 U /Kg。本品能增进病人对肝素的敏感性，并增强其抗凝血作用，这在CABG过程中可以保护关键的血液组分，从而减少微血管出血。本品的安全性在此研究中得到了证实。该刊1999年第4期上刘萍报道了抗凝药Lepirudin。文中指出此药的药效分类为纤维蛋白酶抑制剂，其作用不依赖于抗凝血酶Ⅲ，主要通过抑制凝血酶触发的凝血因子V. m常见的活化以及凝血酶引起的血小板的活化而发挥作用。本品还能使血纤维蛋白酶失活，静脉注射给药预防血栓形成的药效可持续60分钟，用药后作用的持续时间与剂量有关。此药商品名Refludan ；化学名 1—F 苏氨酸—63—脱硫水蛭素；上市开发商：德国Hechst-Marion Roussel 公司, 1997年在德国上市，1998年在英国和美国上市。此外，中国药学杂志2002年第10期上罗鹃报道了美国食品与药品管理局（FDA）于2000年12月批准了Medicines 公司的抗凝新药比伐卢定（Bivalirudin, Angjomax x TM）NDAN 在美国上市，该药系注射用的20肽水蛭素衍生物（片段），相对分子量2180。是直接的，特异的，可逆性的凝血酶抑制剂。
从以上研究的结果可以看出，重组水蛭素是颇有应用前景的活血化瘀药物，其适应症至少包括以下几个方面：1. 治疗外科手术后的静脉血栓，促进显微外科手术伤口的瘀合；2.治疗DI; 3.预防动脉血栓，尤其是在心脏手术后防止冠脉旁路的血栓形成；4. 预防动、静脉血管内溶解血栓后或者血管再造后形成血栓；5.改善体外血液循环，尤其是在血液透析操作中。
